Patch-Clamp-Technik

Medizinische Qualitätssicherung von Dr. med. Nonnenmacher (Facharzt für innere Medizin) am 24. November 2016
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Als Patch-Clamp-Technik wird ein elektrophysiologisches Messverfahren bezeichnet. Dabei lassen sich Ionenströme durch einzelne Kanäle innerhalb einer Plasma-Membran messen.

Inhaltsverzeichnis

Was ist die Patch-Clamp-Technik?

Die Patch-Clamp-Technik oder Patch-Clamp-Methode zählt zur Elektrophysiologie, die einen Teilbereich der Neurophysiologie bildet und sich mit der elektrochemischen Übertragung von Signalen im Nervensystem befasst. Mithilfe dieses Verfahrens ist es möglich, in der Zellmembran einer Körperzelle einzelne Ionenkanäle darzustellen.

Dabei erfolgt eine Messung von Stromstärken, die wenige Picoampere umfassen. Erstmalig beschrieben wurde die Patch-Clamp-Technik 1976 durch den deutschen Biophysiker Erwin Neher sowie den deutschen Mediziner Bert Sakmann. Für die Entwicklung der Clamp-Patch-Technik erhielten die beiden Wissenschaftler 1991 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin. So wurde die elektrophysiologische Forschung durch die Patch-Clamp-Technik geradezu revolutioniert, weil sie die Möglichkeit eröffnete, elektrisches Verhalten an den Membranproteinen von einzelnen Molekülen zu beobachten.

Die Bezeichnung Patch stammt aus dem Englischen und bedeutet übersetzt „Flicken“. Gemeint ist damit ein kleiner Membranausschnitt unterhalb der Patch-Pipette, die als Messelektrode Verwendung findet. Beim Messvorgang erfolgt das befestigen bzw. festklemmen (to clamp) des Membranpatches auf vorgegebenen Potentialen.

Funktion, Wirkung & Ziele

Bei der Patch-Clamp-Technik handelt es sich um eine elektrophysiologische Analysemethode. Sie basiert auf der biologischen Tatsache, dass Zellen eine Vielzahl an Poren und Ionenkanälen besitzen. Im Inneren und Äußeren der einzelnen Zelle kommen verschiedene Ionenkonzentrationen oder Ladungen vor, was vom physiologischen Zustand der Zelle abhängt.

Die Lipiddoppelschicht der Membran ist für Wassermoleküle sowie Ionen nicht durchlässig. Dennoch findet in unregelmäßigen Abständen ein Austausch geladener Teilchen über die Zellmembran statt. Grund dafür ist die Spannungsabhängigkeit der Ionenkanäle. Kommt es zu einem bestimmten Membranpotential, werden die Kanäle nach dem Prinzip „Alles oder nichts“ geöffnet. An genau diesem Punkt setzt die Patch-Clamp-Technik an. So erfolgt das Vorschieben einer Messpipette zu einem Ionenkanal, wobei die Zellmembran nicht durchstoßen wird. Auf diese Weise lässt sich das örtliche elektrische Potential genau bestimmen. Leckströme, die das Resultat der Messung beeinträchtigen könnten, lassen sich durch elektrisch überaus enge Verbindungen zwischen dem Pipettenrand und der Zellmembran zumeist vermeiden.

Aufgebaut ist die Patch-Clamp-Methode auf der Technik der Spannungsklemme (Voltage clamp). Dieses Verfahren war in den 30er Jahren von dem amerikanischen Biophysiker Kenneth Stewart Cole (1900-1984) entwickelt worden, um Ströme an Nervenzellen zu messen, die intakt sind. Bei der Spannungsklemme findet das Einstechen von zwei Elektroden in eine Zelle statt, um eine Kommando- oder Haltespannung vorzugeben. Zur gleichen Zeit erfolgt mit einer anderen Elektrode das Aufzeichnen der auftretenden Ströme über die Membran.

Möchten Neurophysiologen über den Fluss von elektrischen Strömen durch bestimmte Bereiche einer Nervenzellmembran Bescheid wissen, setzen sie die Patch-Clamp-Technik ein. Dazu verwenden sie eine feine Glaspipette, die von außen auf die Zelle aufgesetzt wird. Durch das Ansaugen mithilfe einer Injektionsspritze lässt sich Unterdruck erzeugen. Mit diesem Vorgehen beult sich die Membran an der entsprechenden Stelle etwas aus. Der Unterdruck sorgt dafür, dass das Glas auf der Membran befestigt wird. Dadurch kommt es zur elektrischen Isolation des kleinen Membranflecks in der Pipette von der restlichen Membran.

Zum Messen der elektrischen Ströme greifen die Neurophysiologen auf einen Patch-Clamp-Verstärker zurück. Dabei handelt es sich um ein spezielles Messgerät. Im idealen Fall kann der Wissenschaftler mit dem Gerät Aufschlüsse über die elektrischen Eigenschaften der einzelnen Ionenkanäle erlangen. Von den Ionenkanälen wird zum Beispiel das Ein- und Ausströmen von Natrium-Ionen, die positiv geladen sind, in den Nervenzellen reguliert. Die Untersuchung findet an den Zellen von Menschen, Pflanzen oder Tieren statt.

Vorgenommen wird die Patch-Clamp-Methode in der Regel an einem Messplatz, der unterschiedliche Geräte umfasst. Auf dem schwingungsgedämpften Messtisch befindet sich ein sogenannter Faraday-Käfig, der zur elektrischen Abschirmung dient. Weiterhin ist ein Lichtmikroskop samt Mikromanipulator vorhanden, um die Patch-Pipette in Position zu bringen. Außerdem verfügt der Pipettenhalter über eine Verbindung mit einem Vorverstärker, während der Probenhalter mit einer Badelektrode verbunden ist. Der Patch-Clamp-Verstärker fungiert zum Verstärken des Vorverstärker-Signals. Um das Messobjekt sowie die Patch-Pipette zu beobachten, steht außerdem ein Monitor bereit. In den meisten Fällen sind am Messtisch auch noch ein Computer sowie mehrere Datenspeicher vorhanden, die eine digitale Aufzeichnung ermöglichen.

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Risiken, Nebenwirkungen & Gefahren

Risiken sind mit der Patch-Clamp-Technik nicht verbunden. So werden die Zellen von Menschen, Tieren oder Pflanzen erst nach ihrer Entnahme untersucht. Ein uneingeschränkter Zugang zur äußeren Zellmembran besteht nur selten. Aus diesem Grund ist es oft erforderlich, die Zellen für die Patch-Clamp-Methode vorzubereiten.

Nach dem Füllen der Patch-Pipette erfolgt deren Einspannung in einen Mikromanipulator. Dieser wird an den Patch-Clamp-Verstärker angeschlossen und behutsam auf eine Zelle gedrückt, die intakt ist. Der Vorgang lässt sich mit einem Monitor oder Mikroskop verfolgen. Unter der Pipette sitzt ein Stück Membran, das als Membranfleck oder Patch bezeichnet wird. Der leichte Unterdruck, der am hinteren Pipettenende erzeugt wird, sorgt für eine starke Verbindung zwischen Pipette und Membran. Dieser Vorgang führt zum Entstehen eines elektrischen Widerstands zwischen Außenlösung und Pipetteninnerem von einigen Gigaohm. Wissenschaftler bezeichnen dies auch als „Gigaseal“, wodurch sich die Cell-Attached-Konfiguration der Patch-Clamp-Methode erreichen lässt.

Der Strom, der einen Ionenkanal im Patch durchfließt, fließt aufgrund des hohen Gigaseal-Widerstands auch durch den Inhalt der Pipette. In die Lösung der Pipette wird eine an den Verstärker angeschlossene Elektrode getaucht, wodurch sich die Aktivitäten der einzelnen Ionenkanäle innerhalb der Patchmembran messen lassen.

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