In-situ-Hybridisierung

Qualitätssicherung von Dr. med. Nonnenmacher am 21. September 2017
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Die in-situ-Hybridisierung ist eine Methode zum Nachweis von chromosomalen Aberrationen. Dabei werden bestimmte Chromosomen mit flouroszierenden Farbstoffen markiert und an eine DNA-Sonde gebunden. Diese Technik dient der vorgeburtlichen Diagnostik von Genmutationen.

Inhaltsverzeichnis

Was ist die In-situ-Hybridisierung?

Bei der in-situ-Hybridisierung oder der Floureszenz-in-situ-Hybridisierung werden molekulargenetisch Nukleinsäuren aus RNA oder DNA in bestimmten Geweben oder einer Zelle nachgewiesen. Normalerweise dient diese Art der Diagnostik dem Nachweis einer strukturellen oder numerischen Chromosomenanomalie in der Schwangerschaft.

Hierzu wird eine künstlich hergestellte Sonde verwendet, die selbst aus Nukleinsäure besteht. Sie bindet sich daraufhin durch Basenpaarung an die Nukleinsäuren im Organismus. Diese Bindung ist mit dem Ausdruck der Hybridisierung gemeint. Der Nachweis erfolgt an der lebendigen Struktur des Patienten und entspricht daher einem in-situ-Nachweis. Davon zu unterscheiden sind in-vitro-Verfahren, bei denen der Nachweis im Reagenzglas erfolgt. Das Verfahren wurde im 20. Jahrhundert von den Wissenschaftlern Joe Gall und Mary Lou Pardue entwickelt.

Die Technik hat sich seitdem weiterentwickelt. Während damals zum Beispiel radioaktive Sonden verwendet wurden, werden heute Flouroszenz-markierte Sonden mit einer kovalenten Bindung an die Markierungsmoleküle eingesetzt.

Funktion, Wirkung & Ziele

Die in-situ-Hybridisierung dient in der Regel dem Nachweis von Chromosomenaberrationen, also chromosomalen Anomalien, die nicht in einem Karyogramm nachgewiesen werden können. Damit kommt die Methode immer dann zum Einsatz, wenn Erbkrankheiten noch während der Schwangerschaft bestimmt werden sollen.

Da Chromosomenabberationen heute ein nicht zu unterschätzendes Problem sind, hat sich die Anwendung des Verfahrens über die Zeit gesteigert. Die Hybridisierung erfolgt anhand von nativen Zellen aus dem Fruchtwasser der Mutter. Die Basis der Technik ist die Bindung der farbmarkierten Sonde an DNA-Teile. Mit einem Mikroskop lässt sich dank der Bindung später die Anzahl der Kopien auswerten, da die einzelnen Kopien ein Lichtsignal abgeben und so unter dem Mikroskop sichtbar gemacht werden können. Es gibt dabei unterschiedliche Verfahren. Entweder erfolgt die Analyse unmittelbar nach der Bindung.

In diesem Fall wird ein Flouroszenzfarbstoff wie Biotin verwendet, der direkt an die DNA-Sonde gebunden ist. Bei der indirekten Methode der in-situ-Hybridisierung kann die Auswertung nicht unmittelbar nach der Hybridisierung erfolgen, da fluoreszierende Stoffe erst nach der Hybridisierung an die Sonde binden können. Diese indirekte Methode wird häufiger angewandt als die direkte, da sie für sensitiver gehalten wird. Als Techniken gibt es neben chromosomenspezifischen Zentrometer-DNA-Sonden lokusspezifische DNA-Sonden, chromosomenspezifische DNA-Library-Sonde und vergleichende Genomhybridisierungen.

Chromosomenspezifischen Zentrometer-DNA-Sonden können dem Nachweis chromosomal numerischer Anomalien dienen. Das heißt, dass sie vor allem bei dem Verdacht auf verdoppelte oder gelöschte Chromosomen Einsatz finden. Die lokusspezifischen DNA-Sonden eignen sich vor allem zum Nachweis von minimalen Mutationen, die im Karyogramm nicht nachgewiesen werden können. Eine chromosomenspezifische DNA-Library-Sonde wird insbesondere verwendet, um Insertionen und Translokationen nachzuweisen.

Bei der In-situ-Hybridisierung werden bestimmte Chromosomen mit flouroszierenden Farbstoffen markiert und an eine DNA-Sonde gebunden. Diese Technik dient der vorgeburtlichen Diagnostik von Genmutationen.

Die vergleichende Genomhybridisierung ist dagegen eine umfassende Analyse von Verlusten und Zugewinnen im chromosomalen Material. Heute kommt der in-situ-Hybridisierung ein hoher Stellenwert innerhalb der Diagnostik verschiedener Chromosomenmutationen zu. In der Diagnostik des Down-Syndroms binden sich Sonden zum Beispiel an das Chromosom 21. Hierzu werden in der Regel chromosomenspezifische Sonden verwendet, die bei Verdacht auf diese Erkrankung Einsatz finden können.

Ein Verdacht kann zum Beispiel dann entstehen, wenn die Eltern zuvor bereits ein Kind mit der Krankheit zur Welt gebracht haben und das Ultraschallbild auffällig ist. Wenn eine dreifache statt einer zweifachen Bindung vorliegt und somit ein dreifaches Farbsignal ausgegeben wird, gilt die Diagnose als gesichert.

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Risiken, Nebenwirkungen & Gefahren

Anders als zum Beispiel die PCR ist die in-situ-Hybridisierung für Kontamination deutlich weniger anfällig. Außerdem ist der Zeitaufwand für das Verfahren ungemein geringer. Weil gerade Embryos aber Chromosomenmuster bilden, lässt sich durch ein vorliegendes Muster nicht mit Sicherheit auf den Rest der chromosomalen Verteilung und so den genetischen Status anderer Zellen schließen.

Farbsignale können sich außerdem überlagern oder aus anderen Gründen unsichtbar bleiben. Damit ist die in-situ-Hybridisierung als diagnostisches Instrument während einer Schwangerschaft relativ anfällig für Fehler. Fehldiagnosen können sich einstellen und Eltern können sich unter Umständen gegen ein gesundes Embryo entscheiden. Um die Fehleranfälligkeit der in-situ-Hybridisierung zu verringern, sollten mindestens zwei Embryonal-Zellen gleichzeitig untersucht werden. Durch die parallele Untersuchung zweier Zellen liegt nur mehr ein vernachlässigbares Risiko für Fehldiagnosen vor.

Eltern können sich in einem solchen Fall also durchaus auf die Diagnose verlassen. Die in-situ-Hybridisierung wird nicht jeder Schwangeren, sondern lediglich Frauen aus einer Risikogruppe angeboten. Nichtsdestotrotz wird Schwangeren diese Art der Diagnostik auf eigenen Wunsch hin auch nicht verwehrt. Auffällige Ultraschallbefunde oder ein auffälliges Serum können einen Arzt dazu bewegen, das diagnostische Verfahren anzubieten. Zwar sind über die in-situ-Hybridisierung heute bereits ein großer Teil, aber längst nicht alle Chromosomenabbererationen diagnostizierbar.

Daher darf die in-situ-Hybridisierung niemals alleine durchgeführt werden, sondern muss immer in Zusammenhang mit einem konventionellen Chromosomentest angewandt werden. Die Betreuung der Schwangeren spielt bei diesem Verfahren eine Hauptrolle. Vor der Analyse findet mit der werdenden Mutter daher ein fundiertes Gespräch zur Diagnosemethode statt, das sie über die Risiken, die Möglichkeiten und die Grenzen der Technik aufklärt.

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Quellen

  • Buselmaier, W. et al.: Humangenetik für Biologen. Springer Verlag, Berlin Heidelberg 2005
  • Hennig, W.: Genetik. Springer, Berlin 1995
  • Murken, J., Grimm, T., Holinski-Feder, E., Zerres, K. (Hrsg.): Taschenlehrbuch Humangenetik. Thieme, Stuttgart 2011

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